生長量測定法

1、體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

原理：通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。

菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

2、稱干重法：

原理：利用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。稱干重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

3、比濁法：

原理：微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。該法主要用于發酵工業菌體生長監測。

4、菌絲長度測量法：

方法：對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度

微生物計數法

1、血球計數板法:

這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，并且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2、染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。

3、比例計數法：

將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。

4、液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養液的試管中，經培養后記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然后查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

5、平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

6、試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。試劑紙法計數快捷準確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

7、膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

生理指標法

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸堿度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

1、測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測氮氣法。

2、測定含碳量：

將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線。

3、還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。

4、氨基氮的測定：

方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

5、其他生理物質的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標， 都可用于生長量的測定。也可以根據反應前后的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。

商業化快速微生物檢測法

微生物的檢測，其發展方向是快速，準確，簡便，自動化，當前很多生物制品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用于醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：

1、抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術

2、BACTOMETER 全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統

這些儀器和設備的生產廠家很多，產品各異，在此不做一一介紹，具體可查看各公司的產品說明。

在微生物檢驗操作過程中，要保證檢測環境(如超凈臺、檢測室)以及所用工器具的潔凈程度，同時保證人員各種操作的規范性，盡量保證其無菌性，防止因人為原因操作失誤而出現誤差結果，同時在適宜溫度進行培養，為合理決策和指導生產提供依據。為保證檢測結果的準確性，我們應做好以下幾個方面。

培養基的滅菌及使用

1.每次配制時，要注意其生產日期是否在保質期內，查看其開瓶日期及瓶口密封性，保證其未變質，并且未吸潮。

2.培養基配制時，稱量要準確，包括鹽水的分裝要準確。

3.一定要保證現配制現滅菌，未滅菌的配好培養基不能長時間放置，更不可隔夜。

4.滅菌時要保證恒溫、恒壓，同時要保證有效的滅菌時間。

5.滅菌過的培養基要冰箱保存，可保存一周，一般不超過 3 天。而且要遵循“先入先出”原則，先配制的要先使用。

6.在使用時，要根據當班次的使用量，用水浴鍋先將培養基溶化為液態，然后及時調低水浴溫度（先化好的可從水浴取出，放在水浴鍋鍋蓋上）待用，千萬不可長時間使培養基處于高溫狀態。

7.做產品微生物檢測時，傾倒培養基溫度在 45℃左右，不可過燙，避免將菌燙死；也不可過涼，化好的培養基又結塊凝固，不便于觀察結果。

8.每瓶培養基均要做空白。

9.盡量集中做樣，避免頻繁打開同一瓶培養基瓶塞，增大培養基的污染幾率，出現誤差結果。

10.培養基剩余過少時，可先將其傾倒成空白用板。

檢測環境的維持

1、大環境（檢測室）

（1）檢測時，窗戶和空調要關閉，或用酒精對房間進行噴霧消毒，避免房間內空氣流通影響超凈臺內部環境（最好在有通排風系統的恒溫恒濕無菌間進行操作）。

（2）如果在原來的原料微生物檢測室進行檢測，要定期開啟紫外燈，對房間進行殺菌。

2、小環境（超凈工作臺）

1.定期清潔初效過濾器，要及時更換。

2.檢測前，將超凈臺內部進行清潔，用 75%酒精進行擦拭消毒，并提前半小時將超凈臺紫外燈打開，對超凈臺內部環境進行殺菌。

3.關紫外燈，開風機，調整合適進風量，風量不可過低。

4.每次檢測后，要對超凈臺內部進行清理、清潔，并用 75%酒精進行擦拭消毒。

5.紫外燈根據其使用壽命要及時更換。

6.檢測同時，要做上相應菌落檢測的環境空白。

7.檢測區域的選擇：

a、一般在距離超凈臺外沿的 1/3-2/3 區域進行無菌操作；

b、要在酒精燈火焰的外焰保護區域進行操作。

工器具的潔凈度

1.玻璃器皿：采用干熱滅菌方式進行滅菌。

2.檢測用剪刀、勺子等物品要做到檢測專用，不可與其它操作器具混用，使用時，先用75%酒精消毒，再采用灼燒方式進行滅菌。

3.接種針（環）采用灼燒方式進行滅菌，但要注意檢測時要先將接種針（環）進行冷卻。

樣品的采集及檢測

1、保證采樣器具的無菌性

（1）玻璃器皿：采用干熱滅菌方式進行滅菌，保證恒溫、時間足夠（但不可時間過長，容易導致玻璃器皿易裂紋而報廢）。

（2）取樣筐：使用前要用75%酒精進行噴灑消毒。

（3）取樣勺：要保證其清潔消毒，清潔后用75%酒精進行擦拭消毒。

（4）取樣袋：可先用酒精進行擦拭消毒，再在超凈臺用紫外燈照射消毒，（包裝車間要在傳遞窗用紫外燈照射消毒）。

（5）電子稱表面用 75%酒精消毒。

2、人員操作

（1）保證手部的清洗、消毒：取樣前及檢測前都要先洗手再消毒。

（2）取樣要具有代表性（隨機樣、目的樣、綜合樣）且要標示清楚。

（3）取樣完畢，不可在車間逗留，要及時將樣品放入超凈臺，對其外表面進行紫外燈照射消毒。

（4）在要求的檢測區域進行操作。

（5）檢測前，要用 75%酒精棉球對樣品袋口部進行擦拭消毒，再開口。

（6）往鹽水瓶加樣品時，要注意勺子或袋子盡量不接觸瓶口。

（7）樣品計量要準確，稀釋倍數也要準確（1mL 吸管不允許將管口敲掉），進行 100 倍稀釋時，1mL 吸管要伸入鹽水中，不可以將樣品從管壁流下去，同時要避免將管底部捅破。

（8）鹽水溫度以 40℃左右為宜，不能過熱，會將部分微生物燙死；也不能溫度太低，不能將樣品溶解完全。

（9）進行稀釋時，要搖勻，保證溶液的均一性。

（10）傾倒平皿時，要注意培養基瓶口不要接觸到平皿；傾倒的培養基要適量，不可以太少，在培養過程中易干掉，微生物亦死亡，以 15mL 左右為宜。

（11）做大腸菌群樣時，要提前將乳糖膽鹽培養基培養管按需要量備好，放入超凈臺對外表面進行紫外線滅菌。

（12）接二步時，要注意先將接種針（環）進行冷卻，避免出現接不上菌落的情況，導致無法判斷、確認。

（13）檢測完畢，及時放入相應培養箱進行培養，并清理清潔超凈臺。

微生物的培養

1.在培養過程中，要隨時監控培養箱溫度，保證其在適宜的溫度進行培養。

2.要按照《微生物檢驗規范》要求及時觀察結果，出現異常，要及時分析原因進行反饋。

思考與討論

    微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個體生長在科研上有一定困難，通常情況下也沒有實際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長通常指群體的擴增。

信息來源：藥品微生物檢驗